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Studie: Assessment of Toxic and Ecotoxic Properties of Novel Proteins in GMOs

Die im Auftrag des ehemaligen BMGFJ verfasste Studie mit dem Titel "Assessment of Toxic and Ecotoxic Properties of Novel Proteins in GMOs" ist von einem Autorenteam des IFZ Graz (Inter-University Research Centre for Technology, Work and Culture) sowie des Umweltbundesamt Wien unter der Leitung von Dr. Armin Spök sowie Mag. Marion Dolezel erstellt worden und ist im Jahr 2008 erschienen.

(25.03.2008)

Zusammenfassung:

Untersuchungen zur Toxizität von Proteinen sind ein Aspekt der Risikoabschätzung gentechnisch veränderter Pflanzen (GVP). In Zukunft könnte diesem größere Bedeutung zukommen, wenn die Exposition von neuen Proteinen in gentechnisch veränderten Pflanzen, die Konzentration in der Pflanze oder der Grad an Neuartigkeit der Proteine zunehmen oder wenn Nahrungsmittelpflanzen für die Herstellung von Proteinen für pharmazeutische und industrielle Zwecke verwendet werden (Molecular Farming).

Ziel der vorliegenden Studie ist es,

  • die derzeitige Praxis der Abschätzung von toxischen und ökotoxischen Eigenschaften von neu exprimierten Proteinen in gentechnisch veränderten Pflanzen zu analysieren,
  • Schwachstellen zu identifizieren und
  • Vorschläge für Verbesserungen zu machen.

Allergene Eigenschaften von Proteinen wurden dabei explizit nicht berücksichtigt. Zu diesem Zweck wurden die toxikologische und ökotoxikologische Praxis der Risikoabschätzung von GVP durch die Antragsteller, die relevanten Gesetze und Leitlinien sowie die publizierte Literatur analysiert. Ergebnisse eines ExpertInnenworkshops, bei dem für die Studie relevante Hypothesen und Ansichten diskutiert wurden, wurden ebenso berücksichtigt wie mündliche und schriftliche Kommentare von ExpertInnen aus Wissenschaft, Industrie und Behörden. Die Analyse fokussiert auf die Datenbasis zur Toxizität und Ökotoxizität von Proteinen im Allgemeinen sowie spezifisch in Bezug auf Proteine, die in GVP eingebracht werden, wie beispielsweise bakterielle Cry-Proteine. Jene Hypothesen, die der toxikologischen und ökotoxikologischen Risikoabschätzung von GVP zugrunde liegen, wurden ebenso analysiert wie die angewandten Methoden für deren Bewertung. Darüber hinaus werden auch andere regulatorische Bereiche wie Lebensmittelenzyme und Biopestizide vergleichend angesprochen. Zudem werden mögliche Verbesserungen der toxikologischen und ökotoxikologischen Risikoabschätzung im Zusammenhang mit GVP vorgeschlagen und diskutiert.

Teil A: Abschätzung von humantoxischen und anti-nutritiven Eigenschaften

Teil A zur Bewertung von möglichen humantoxischen Eigenschaften von Proteinen analysiert Leitlinien und die Abschätzungspraxis in Bezug auf Zugang, Grundannahmen, Methoden und Art der berücksichtigten Informationen auf Basis von Risikoabschätzungsdossiers, Evaluierungen dieser Dossiers und wissenschaftlicher Literatur. Vergleichend wird die Vorgangsweise bei der Proteintoxizitätsabschätzung von Lebensmittelenzymen und Biopestiziden untersucht. Den Hintergrund bildet eine Zusammenschau der wissenschaftlichen Literatur zu Proteinen, die bei oraler Aufnahme toxische oder anti-nutritive Eigenschaften haben können.

Die Toxizitätsabschätzung von neu exprimierten Proteinen im Kontext von GVP erfolgt fallspezifisch (case-by-case). In den meisten Leitlinien und in der Praxis erfolgt die Gefahrenerkennung und -charakterisierung auf Basis

  1. der Charakterisierung des Donororganismus;
  2. der Klärung der physiologischen Rolle, des biochemischen Wirkmechanismus und der Spezifität des Proteins;
  3. der vorhandenen Erfahrungen mit dem Protein in der menschlichen Ernährung bzw. der Exposition;
  4. von Sequenzhomologievergleichen zu bekannten Toxinen;
  5. von In-vitro-Verdauungsstudien und
  6. von akuten Toxizitätstests mit Nagern.

Bei diesem Ansatz wurden folgende Schwachstellen identifiziert:

  • Die Erfahrungen mit den neu exprimierten Proteinen in der menschlichen Ernährung bzw. Exposition beziehen sich zumeist nicht auf wissenschaftliche Studien; mitunter werden diese auch nicht mit dem identen Protein, sondern mit ähnlichen bzw. homologen Proteinen gewonnen.
  • Am Beispiel von GVP, die Cry-Toxine exprimieren, lässt sich zeigen, dass auch nach mehr als 12 Jahren nach der Erstzulassung solcher GVP immer noch offene Fragen bezüglich möglicher physiologischer Effekte in Menschen bestehen.
  • Für Sequenzhomologievergleiche zu bekannten Toxinen gibt es - anders als bei derartigen Vergleichen zu bekannten Allergenen - keine Leitlinien. Manche der Sequenzvergleiche datieren mehr als zehn Jahre zurück. Eine Aktualisierung wird unter Umständen von Firmenseite auf freiwilliger Basis durchgeführt, aber zumindest mehrheitlich nicht durch Behörden überprüft. Dies erfolgt auch nicht bei der Verlängerung der Marktzulassung oder bei der Zulassung von anderen GVP, die das gleiche Gen exprimieren.
  • Das Testprotein für In-vivo-Toxizitätstests stammt nahezu ausschließlich aus mikrobieller Herstellung, da eine Reinigung aus Pflanzen aufgrund zu geringer Expressionslevel als zu aufwendig angesehen wird. Zudem werden Äquivalenzuntersuchungen von pflanzlichen mikrobiellen Proteinen in unterschiedlicher Weise durchgeführt.
  • In-vitro-Verdauungsstudien weisen eine beträchtliche Variabilität im experimentellen Design auf, was die Resultate und Schlussfolgerungen beeinflussen kann. Zudem stellt sich die Frage nach der Relevanz dieser Studien für die In-vivo-Situation, in der beispielsweise der pH-Wert des Magens deutlich höher sein kann und das exprimierte Protein in einer Lebensmittelmatrix vor proteolytischem Abbau geschützt sein kann.
  • Toxizitätstests mit Tieren werden als nicht notwendig angesehen, wenn die oben beschriebenen Studien bzw. Informationen nahe legen, dass das Protein über keine toxischen Eigenschaften verfügt. Mögliche Anlassfälle für In-vivo-Studien sind:

    i. problematische/r oder unbekannte/r Wirkmechanismus oder Spezifität,
    ii. toxische Wirkungen auf Säugetiere,
    iii. nicht dokumentierte Exposition von Mensch und Tier,
    iv. falls die geschätzte Exposition negative Gesundheitsfolgen auslösen könnte,
    v. Änderungen der Primärstruktur und
    vi. falls das Protein in In-vitro-Verdauungsstudien nicht rasch abbaubar ist.

    Vorgeschlagen werden je nach Leitlinie akute (USA) oder 28-Tage-subchronische Toxizitätsstudien
    (EU). Subchronische 28-Tage-Studien sind bislang mit wenigen Ausnahmen nicht durchgeführt worden.
  • Subchronische 90-Tage-Fütterungsstudien mit der ganzen gentechnisch veränderten Pflanze und Nagern können zusätzliche sicherheitsrelevante Informationen für das neu exprimierte Protein ergeben, abhängig unter anderem vom Studiendesign, den spezifischen Proteineigenschaften und der Pflanzenspezies.
  • Diese starke Gewichtung von Ex-vivo-Studien zu Ungunsten von In-vivo-Toxizitätstests lässt sich im Vergleich zu den regulatorischen Kontexten von Lebensmittelenzymen und Biopestiziden argumentieren, da in diesen der Fokus der Tierstudien eher auf Begleitstoffen und Kontaminanten aus der Fermentation liegt (Mycotoxine und bakterielle Toxine). Auf der anderen Seite wird dies als problematisch angesehen, da Anzeichen von subchronischen Effekten nicht notwendigerweise in akuten Studien entdeckt werden. Der derzeitige Wissensstand suggeriert zwar, dass toxische Proteine sehr häufig akute Wirkungen haben, gleichzeitig scheint es aber kaum Forschungsanstrengungen zur Exploration von möglichen toxischen Effekten jenseits von akuten Wirkungen zu geben. Eine Ausnahme hiervon sind beispielsweise Lektine, bei denen allerdings nicht in jedem Fall klar ist, welche Effekte als toxisch und welche als anti-nutritiv eingestuft werden. Zudem ist unklar, ob diese Grenzziehung überhaupt von Bedeutung ist, da auch anti-nutritive Effekte bei längerer Exposition zu deutlichen Gesundheitsbeeinträchtigungen führen können.
  • Ebenso problematisch ist der völlige Entfall von In-vivo-Toxizitätstests entsprechend den EFSA-Leitlinien - im Wesentlichen aus zwei Gründen: Erstens ist eine ausschließliche Beurteilung der Toxizität eines neu exprimierten Proteins aufgrund von Ex-vivo-Untersuchungen aufgrund der identifizierten Schwachstellen fragwürdig. Zweitens liegen noch keine Erfahrungswerte vor, die eine Einschätzung zulassen, ob solche Eigenschaften durch die Ex-vivo-Studien erkannt werden würden. Von den mehr als 40 verschiedenen Proteinen, bei denen eine Toxizitätsabschätzung durchgeführt worden ist, wurde bislang kein Protein als problematisch identifiziert und es wurden keine (weiteren) Toxizitätstests verlangt.
  • Falls eine quantitative Expositionsabschätzung vorliegt, erfolgt diese häufig auf Basis der Proteinkonzentration in der Pflanze, auf Basis von Datenbanken zu Nahrungsmittelaufnahmen und worst-case-Annahmen, wie z. B. kein Proteinabbau und hoher Proteinanteil in der menschlichen Ernährung. Eine formale Risikocharakterisierung wird weniger häufig durchgeführt. Teilweise werden dabei toxikologische Endpunkte wie z. B. der NOAEL (no observed adverse effect level) auf Basis akuter Toxizitätstests berechnet, was im Widerspruch zur normalen toxikologischen Praxis steht, in der von mindestens 90 Tage dauernden subchronischen Tests ausgegangen wird.

Aufgrund dieser Analyse wird Forschungsbedarf zu möglichen toxischen Wirkungen jenseits von akuten Effekten, zur Relevanz der In-vitro-Verdauungsstudien für die In-vivo-Situation sowie zur Absorption von Proteinen aus dem Verdauungstrakt gesehen. Bedarf an Leitlinien auf EU-Ebene ist für das Design von In-vitro-Verdauungsstudien, Sequenzhomologievergleiche und für die Berücksichtigung von Erfahrungen mit vorheriger menschlicher Exposition gegeben. Klarstellungen sind ferner erforderlich bezüglich der Unterscheidung toxischer und anti-nutritiver Eigenschaften und der Festlegung, welche Effekte klar außerhalb des Fokus der GVP-Risikoabschätzung liegen. Außerdem sollte geklärt werden, in welchen Fällen eine Produktion des Testproteins aus Pflanzen durchführbar ist.

Teil B: Abschätzung der Ökotoxizität

 

Teil B analysiert und diskutiert die derzeitige Praxis der ökotoxikologischen Risikoabschätzung von in GVP eingebrachten Proteinen sowie die der Risikoabschätzung zugrunde liegenden Annahmen und angewandten Methoden. Zudem werden Fragen der Protein-Ökotoxizität von Bakterien, Pilzen und Pflanzen im Allgemeinen und spezifisch in Bezug auf die für GVP relevanten, bakteriellen Cry-Proteine angesprochen. Anträge, die den Anbau von GVP in der Europäischen Union inkludieren, gesetzliche Vorgaben und Leitlinien sowie die publizierte Literatur bilden die Grundlage dieser Analyse.

Die derzeitige Praxis der ökotoxikologischen Risikoabschätzung von bakteriellen Cry-Proteinen geht von folgenden Annahmen bezüglich der Protein-Ökotoxizität aus:

  1. Proteine können nur akut wirken;
  2. Proteine wirken hoch spezifisch gegen einen bestimmten Schädling;
  3. Proteine werden schnell im Ökosystem abgebaut;
  4. mehrere in eine gentechnisch veränderte Pflanze eingebrachte Proteine interagieren nicht.

Aufgrund dieser Annahmen stützt sich die ökotoxikologische Risikobewertung von GVP derzeit auf akute Kurzzeit-Toxizitätstests mit wenigen, ausgewählten Nichtzielorganismen sowie Kurzzeittests zum Proteinabbau im Boden. Systematische Expositionsanalysen und Risikocharakterisierungen für Nichtzielorganismen fehlen meist.

Folgende Schwächen der derzeitigen Praxis der ökotoxikologischen Risikoabschätzung von in GVP eingebrachten Proteinen können somit festgestellt und Handlungsempfehlungen abgeleitet werden:

  • Das Fehlen systematischer Expositionsanalysen von Nichtzielorganismen lässt die Verfügbarkeit von Cry-Proteinen über unterschiedliche Expositionswege wie direkte oder indirekte Nahrungsaufnahme bzw. über Abbauprodukte in Wasser, Boden oder Sedimenten unberücksichtigt. Hinsichtlich der Durchführung von Expositionsanalysen und Risikocharakterisierungen - wie dies auch in anderen regulatorischen Bereichen, z. B. mikrobiellen Pflanzenschutzmitteln, der Fall ist - sind daher Verbesserungen notwendig.
  • Die derzeit vorgelegten Studien zur Ökotoxizität und zum Proteinabbau von Cry-Proteinen in GVP sind hinsichtlich des Versuchsdesigns, der Methode, der Auswahl der Testorganismen und der Testdauer als unzureichend zu bewerten. Wesentliche Erkenntnisse zur Proteintoxizität, die über die akut toxischen Wirkungen und die Kurzzeitpersistenz hinausgehen, bleiben in den GVP-Anträgen unberücksichtigt. Daher sind klare Vorgaben auf EU-Ebene für die Antragsteller in Bezug auf die Auswahl der Testorganismen, die zu verwendende Methodik sowie die Testparameter notwendig.
  • Unklarheiten bestehen hinsichtlich der Spezifität und biologischen Wirksamkeit der  in den ökotoxikologischen Tests verwendeten Cry-Proteine als Testsubstanz. Daher sollten bei der Auswahl der Testsubstanz die realen Bedingungen besser abgebildet und ganze Pflanzen bzw. Pflanzenteile in die Tests aufgenommen werden. Damit können Unterschiede zwischen Proteinen, die in Pflanzen bzw. Mikroorganismen exprimiert werden, sowie die Zusammensetzung der Wirtspflanze berücksichtigt werden.
  • In den GVP-Anträgen wird derzeit für ökotoxikologische Tests selten auf standardisierte Testprotokolle zurückgegriffen. Eine Verwendung standardisierter Protokolle (z. B. OECD) ist jedoch unumgänglich, um valide Testergebnisse zu erhalten. Zudem ist eine Adaptierung der vorhandenen Testprotokolle oder die Entwicklung neuer Protokolle für ökotoxikologische Tests, die den spezifischen Anforderungen von GVP gerecht werden, nötig.
  • Mögliche Interaktionen mehrerer ökotoxischer Proteine, die in eine GVP eingebracht werden, dürfen nicht unberücksichtigt bleiben und müssen in ökotoxikologische Bewertungen inkludiert werden.

Forschungsbedarf besteht insbesondere für die folgenden Bereiche:

  • Es bestehen Unsicherheiten bezüglich der Spezifität und biologischen Wirksamkeit von Cry-Proteinen gegenüber Ziel- und Nichtzielorganismen im Allgemeinen und speziell in Bezug auf Cry-Proteine, die in ökotoxikologischen Tests verwendet werden (exprimiert in GVP oder Bakterien). Der derzeitige Wissensstand zur Ökotoxizität von Cry-Proteinen ist daher dringend zu verbessern.
  • Die derzeitige Datenbasis über das Schicksal und Verhalten von Cry-Proteinen in unterschiedlichen Umweltkompartimenten sowie in der Nahrungskette ist äußerst limitiert. Mit dem großflächigen Anbau von GVP ist das Vorhandensein dieser Proteine in den verschiedensten Habitaten und Organismen zu erwarten. Deshalb ist ein fundiertes Verständnis des Verhaltens und der Persistenz dieser Proteine wesentlich.

 

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