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Studie: Frequency of Environmental Antibiotic Resistance (FEAR)

Die Studie: „Frequency of Environmental Antibiotic Resistance (FEAR)” beschäftigt sich mit der Häufigkeit von nptII und nptIII Antibiotikaresistenzgenen in natürlich vorkommenden Bakterienpopulationen in Österreich.

Ziel des Projekts ist eine umfassende Darstellung des gegenwärtigen Zustands bezüglich Hintergrundbelastung von relevanten, bisher nicht künstlich kontaminierten Ökosystemen mit nptII und nptIII Genen in Österreich vor einem eventuellen Anbau antibiotikaresistenzmarkergen-tragender transgener Pflanzen.

Die Studie wurde im Auftrag des ehemaligen BMG und BMLFUW, unter der Leitung von Mag. Markus Wögerbauer, von der Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit verfasst, in Kooperation mit der University of Natural Resources and Life Sciences Vienna und der University of Tromsø.

Teile der Studie wurden bereits unter Woegerbauer M, Zeinzinger J, Springer B, Hufnagl P, Indra A, Korschineck I, Hofrichter J, Kopacka I, Fuchs R, Steinwider J, Fuchs K, Nielsen KM, Allerberger F. 2014. Prevalence of the aminoglycoside phosphotransferase genes aph(3')-IIIa and aph(3')-IIa in Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subsp. enterica and Staphylococcus aureus isolates in Austria. J Med Microbiol 63:210-217. veröffentlicht.

Weitere Aspekte der Studie wurden unter Woegerbauer, M., J. Zeinzinger, R. A. Gottsberger, K. Pascher, P. Hufnagl, A. Indra, R. Fuchs, J. Hofrichter, I. Kopacka, I. Korschineck, C. Schleicher, M. Schwarz, J. Steinwider, B. Springer, F. Allerberger, K. M. Nielsen and K. Fuchs (2015). Antibiotic resistance marker genes as environmental pollutants in GMO-pristine agricultural soils in Austria. Environmental Pollution 206: 342-351. veröffentlicht.

Zusammenfassung

Bodenbakterienpopulationen wurden auf die Prävalenz von nptII und nptIII mit kultivierungsabhängigen und –unabhängigen metagenomischen Verfahren getestet. Es wurden 100 Bodenmischproben von jeweils 50 Mais- und 50 Kartoffelfeldern untersucht. Insgesamt wurden 1000 Einzelbodenprobenextrakte gezogen. Die Analyse der Gesamt-Boden-DNA zeigte, dass 6% der Bodenproben positiv auf das Vorhandensein von nptII Genen (95% Konfidenzintervall [2,2%; 12,6%]) waren. Im Mittel konnten 340 nptII Genkopien/g Boden (Minimum: 31 Kopien/g Boden; Maximum: 850 Kopien/g Boden) in den positiv getesteten Feldern detektiert werden. Eine im Jahr 2011 publizierte Studie von Ma et al. in Kanada kommt hinsichtlich der niedrigen Prävalenz und der geringen Kopienanzahl von nptII in landwirtschaftlich genutzten Anbauflächen zu einem ähnlichen Ergebnis. 85% aller Bodenproben wurden positiv auf nptIII getestet [76,5%; 91,4%], welche eine durchschnittliche Hintergrundbelastung von 4750 Kopien/g Boden (Bereich 13 bis 61.600 Kopien/g Boden) in den positiv getesteten Feldern aufwiesen. Für die einzelnen Felder wurden umfangreiche Zusatz-Daten gesammelt und ausgewertet. Es wurde eine starke Korrelation zwischen organischer Düngung und der Prävalenz von nptIII Genen festgestellt. Im Durchschnitt waren 8.29% aller kultivierbaren Bakterien aus zehn Referenzfeldern resistent gegen Kanamycin (Bereich: 0,47 bis 19,12%). 396 gegen Kanamycin resistente Bakterienstämme wurden isoliert und taxonomisch charakterisiert. Keiner dieser Stämme konnte als Träger für nptII identifiziert werden (95% Konfidenzintervall [0%; 0,8%]). Die durchschnittliche Prävalenz der nptIII positiven Stämme betrug 1,8% ([0%, 3,3%]). In einigen Feldern konnten humanpathogene Stämme (z.B. Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia) identifiziert werden. Weiters wurde die mikrobielle Diversität dieser zehn Referenzfelder mittels Pyrosequenzierung untersucht. Es konnten zwischen 194 und 268 Gattungen in den Bodenproben identifiziert und ihre relativen Anteile ermittelt werden. Humanpathogene Gattungen kommen dabei ebenfalls vor. Im Vergleich zu nptIII ist die natürliche Hintergrundbelastung von nptII Resistenzgenen in für Mais- und Kartoffelanbau genutzten landwirtschaftlichen Habitaten in Österreich gering. Unseres Wissens war dies der bisher umfassendste Ansatz, um Daten über die Prävalenz von Resistenzgenen in 100 Bodenproben mit verschiedenen Bodentypen zu sammeln und mit umfangreichen zusätzlichen spezifischen Bodendaten auszuwerten.

Das Habitat Pflanze bzw. Futtermittel wird repräsentiert durch Mais- und Kartoffelproben, welche routinemäßig im Rahmen von Kontrollen des Bundesamtes für Ernährungssicherheit in Österreich gesammelt werden. Zweiundvierzig Gesamt-DNA-Extrakte wurden auf die Prävalenz von nptII und nptIII analysiert. Keine Probe war positiv auf eine der beiden Aminoglykosidphosphotransferasen (95% Konfidenzintervall: [0%; 6,9%]). Bis zu 73,05% der aus Mais gewonnenen Bakterienpopulation waren resistent gegen Kanamycin, während aus Kartoffeln gewonnene Bakterien eine maximale Kanamycin-Resistenz von 6,6% aufwiesen. Ein einzelnes Bakterienisolat wurde nptII positiv getestet (Prävalenz Schätzer: 1,1%; 96%-Konfidenzintervall: [0%, 4,9%]). Obwohl nur eine kleine Anzahl von bakteriellen Proben getestet wurde, unterstützen die erhaltenen Ergebnisse die Hypothese einer niedrigen natürlichen Hintergrundbelastung von nptII und nptIII Genen in Mais und Kartoffeln, welche im Untersuchungszeitraum in Österreich angebaut und als Futtermittel verwendet wurden.

Eine in silico Analyse der nptII Gensequenz mit anderen Aminoglycosidphosphotransferasegenen zeigt keine ausgeprägten Bereiche mit DNA Ähnlichkeit. Die identifizierten zusammenhängenden DNA Abschnitte mit totaler Sequenzidentität sind extrem kurz. Das deutet darauf hin, dass homologe Rekombination zwischen nptII und den anderen untersuchten Aminoglycosidphosphotransferasegenen nicht der primäre Weg zum Austausch von DNA Fragmenten und zur Sequenzevolution ist. Es verbleibt jedoch die Möglichkeit eines DNA Austausches zwischen Aminoglycosidphosphotransferasegenen durch illegitime Rekombination, da Bereiche mit Microhomologien auftreten. BLAST Sequenzalignments mit Standardparametern zeigen, dass sich keine nptII Mosaikgene natürlichen Ursprungs in GenBank befinden. Die aus der in silico Analyse gewonnenen Daten unterstützen nicht wesentlich die Hypothese einer Beteiligung von nptII an der Bildung von Mosaikgenen mit anderen Aminoglycosidphosphotransferasegenen, die zur Veränderung des Resistenzmusters führen können. Es gibt jedoch Hinweise aus im Rahmen des Projekts durchgeführten Experimenten, dass nptII codierende DNA mit ausgewählten Aminoglycosidphosphotransferasegenen, die zuvor in Acinetobacter baylyi kloniert worden waren, nach natürlicher genetischer Transformation rekombinieren. Die Ergebnisse konnten durch Sequenzierung der vermutlichen Zielregionen nicht bestätigt werden.

Ein Computer-Modell zur Simulation des horizontalen Gentransfers von aus Pflanzen freigesetzten Antibiotikaresistenzgenen auf die Bakteriengemeinschaften im Boden erweitert das Schlüsselwerk von Townsend et al. und bestätigt, dass die Fixierung eines neu eingebrachten Gens ein langfristiger Prozess ist, welcher extrem vom Selektionsdruck im jeweiligen Habitat abhängig ist. Bezieht man die Abbauprozesse von pflanzlichem Material ins Model mit ein, zeigt sich dass auch die Häufigkeit des horizontalen Gentransfers bei der Fixierung eines neuen Genotyps in einem gewissen Ausmaß eine Rolle spielt.

Die Wirkung des durch Antibiotika in Böden erzeugten Selektionsdrucks wird umfangreich diskutiert. Die Analyse aktueller Literatur zeigt, dass Antibiotikamengen, die um das Hundertfache unter den tatsächlichen minimalen Hemmkonzentrationen von empfindlichen Bakterien liegen, effektiv resistente Bakterien selektieren und dass diese niedrigen, in natürlicher Umgebung zu findenden Antibiotikakonzentrationen wichtig für Anreicherung und Erhalt von Resistenzen in Bakterienpopulationen sind.

Die natürlich vorkommende Prävalenz von zwei Antibiotikaresistenzmarkergenen - Neomycinphosphotransferase II und Neomycinphosphotransferase III – wurde mit TaqMan real time PCR in den Habitaten „Menschliche Krankheitserreger“, „Boden“ und „Futtermittel“ in Österreich bestimmt.

In der klinisch relevanten Umgebung wurden folgende humanpathogene Bakterien auf nptII und nptIII Resistenzgene untersucht, welche prospektiv in den Jahren 2010 - 2011 von klinischen Labors repräsentativ in allen österreichischen Bundesländern gesammelt wurden: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Zusätzlich wurden Salmonella enterica subsp. enterica Isolate der Stammsammlung des österreichischen Referenzlabors für Salmonella retrospektiv für den Zeitraum 2008 – 2010 analysiert. Von insgesamt 10 400 auf nptII und nptIII Resistenzgene untersuchten Isolaten wurde ein einzelner Salmonellenstamm positiv als Träger von nptII getestet. Alle anderen Isolate waren nptII negativ. Mit einer Sicherheit von 95% war die Prävalenz von nptII bei Escherichia coli niedriger als 0.70% [0%; 0.70%], bei Enterokokken niedriger als 0.75% [0%; 0.75%], bei Staphylococcus aureus niedriger als 0.73% [0%; 0.73%], bei Pseudomonas aeruginosa niedriger als 0.32% [0%; 0.32%] und bei Salmonella spp. niedriger als 0.058% [0%; 0.058%]. In Klammer ist das 95% Konfidenzintervall angeführt. Bei nptIII lagen die Prävalenzen – innerhalb eines 95% Konfidenzlimits - bei Escherichia coli unter 1.47% [0%; 1.47%], bei Enterokokken unter 42.4% [32.84%; 42.4%], bei Staphylococcus aureus unter 5.02% [1.51%; 5.02%], bei Pseudomonas aeruginosa unter 0.32% [0%; 0.32%] und bei Salmonella enterica subsp. enterica unter 0.037% [0%; 0.037%]. Die erzielten Ergebnisse bestätigen mit einer Sicherheit von 95% die Hypothese einer niedrigen Prävalenz von nptII in den repräsentativ in Österreich gesammelten und analysierten humanpathogenen Bakterienisolaten.

Schlussfolgerung

Die natürlich vorkommende Hintergrundbelastung von nptII Resistenzgenen in den in Österreich getesteten bakteriellen Habitaten scheint niedrig zu sein. Die erzielten quantitativen Ergebnisse zeigen, dass die untersuchten Resistenzgen-Pools nicht mit nptII Genen gesättigt sind. Die Baseline- Frequenz von nptII in diesen natürlichen Lebensräumen ist in der Regel deutlich niedriger im Vergleich zur Prävalenz von nptIII in den gleichen Habitaten. Die Ergebnisse zusammenfassend betrachtet deuten darauf hin, dass die untersuchten Resistenzgen-Pools nicht mit nptII Genen gesättigt und daher aufnahmefähig für den Input exogener DNA mit Aminoglycosidphosphotransferase (3 ')-IIa-Gen Homologen sind. Eine langfristige und konstante Exposition dieser Lebensräume mit exogener nptII codierender DNA könnte in der Lage sein, die Häufigkeit dieser Resistenz-Determinante in diesen Ökosystemen zu erhöhen.

(17.11.2015)

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